Генното инженерство позволява прекрачването на видовите бариери

В нашето ежедневие все по-често се споменава терминът клониране.

Клониране на гени – пренасяне на гени от един организъм в друг, при което акцептора придобива нови свойства. Посредством клонирането на гени се създават така известните в нашето ежедневие Генно модифицирани организми – ГМО.

Получаване на желания фрагмент от ДНК на организма донор;

Обединяване на таргетната секвенция с определен вектор;

Внасяне на вектора в акцепторната клетка.

Да могат да самореплицират всички включени в тях участъци;

Да съдържат специфични участъци, служещи за тяхното разпознаване;

Да сърържат специфичен рестрикционен сайт (или няколко) позволяващи даден рестриктазен ензим да среже тяхната верига;

Да съдържат в себе си селективни маркерни гени (най често за устойчивост към антибиотици).

Изкуствени бактериални хромозоми – обикновено това са вектори вградени в F фактора на бактериата. Те имат възможността да пренасят ДНК фрагменти до 1000 кило бази.

Видове приемни клетки:

Клетки на нисши еукариоти – обикновено се използват приемни клетки на дрожди. Техният геном е сравнително голям, което дава възможност за клонирането на фрагменти с големина до 1000 кило бази.

Перспективи пред генното инженерство

Най-нови експерименти показват възможност за конструиране на генетично модифицирани микроорганизми (E. coli), способни да разграждат различни замърсители в природата, да усвояват азота от атмосферата и др.

Проект „Развитие на център за електронни форми на дистанционно обучение в Тракийски университет“ BG051PO001-4.3.04-0026

Под термина генно инженерство се разбира методология за получаване и комбиниране на ДНК молекули в клетъчна среда. Генното инженерство се занимава с извличане на гени от един организъм и пренасянето им в друг. За извършването на това вмешателство в генома на даден организъм е необходимо да се преодолеят редица биологични бариери.

Клониране на организми – асексуално възпроизводство на индивиди, генетично еднакви с организма, от който са били клонирани. Поради изключителната опасност и нарушаване на биоетичните норми, този тип клониране е строго забранен в по-голямата част от света. Механизмите, които са били използвани за получаване на клонинги се базират на отстраняването на ядрото на яйцеклетката и пренасянето на ядро от соматична клетка на друг индивид. Повечето автори прилагат електрически шок върху получената клетка, вследствие на което тя започва да се дели и образува зигота. Пример за такъв клонинг е световно известната овца Доли. На практика клонирането на цели организми е почти невъзможен процес (базирано на знанията на биолозите към момента), поради факта, че някои от гените в пренесеното ядро вече са супресирани, тъй като те са кодирали продукти за ембриогенезата в организма. Веднъж „изключени“ тези гени не се експресират, поради което огромна част от клонираните клетки загиват още през първите часове от развитието си. Отклонения са описвани и в строежа на органите при абортирали плодове. Установява се, че огромна част от клетките в жизненоважни органи – черен дроб, бъбреци и др. липсват или са с нехарактерен строеж, поради което плодовете се абортират или умират малко след раждането. Клонирането на цели организми доведе и до задаването на много въпроси, свързани с биоетиката и развитието на човечеството като цяло.

По този начин са получени редица бактерии, в които са били пренесени гени кодиращи важни за човека белтъчини. Пример за такива белтъчини е хормонът инсулин, чиито ген от десетилетия е пренесен в бактерията E. coli. Така бактериите синтезират този важен продукт за инсулинзависимите диабетно болни хора. По този механизъм са получени и редица растения, които са придобили възможността да се развиват на по-студена или по-топла среда, устойчивост към насекоми, бактерии, вируси, високи концентрации на тежки метали и др.

Под клониране на ДНК се разбира процесът на интеграция на участъци от ДНК произхождащи от един организъм (донор) в ДНК верига принадлежаща на друг организъм (акцептор). Необходимо условие за осъществяване на ДНК клонирането е правилното включване на чуждите ДНК фрагменти в участък от ДНК на акцептора, която има способността да се самовъзпроизвежда. Ако пренасяният фрагмент е правилно включен при всяка репликация на молекулата реципиент, то пренесеният участък ще се предаде на дъщерните вериги.

Пренасянето на даден ДНК фрагмент не е възможно да бъде извършено пряко. Винаги се използва определен посредник – вектор. За пренасянето на фрагментите от една ДНК верига на друга важно участие вземат описаните по-горе рестрикционни ензими. Обикновено се използват един или два рестрикционни ензима, които изрязват желания участък от веригата донор. Знаейки нуклеотидната последователност на таргетният участък (особено в неговите крайща), се подбира ензим който срязва така веригата, че в двата и края да остане едноверижен участък, изграден от един или няколко нуклеотида. Тези едноверижни участъци се означават като лепливи краища на веригата. Обикновено същите ензими се използват за рестрикция и на дестинейшън веригата, като при нейното срязване също остават лепливи крайща, комплементарни на крайщата на пренасяният фрагмент. При смесването на двете молекули по принципа на комплементарността едноверижните участъци се съединяват и изграждат химични връзки по между си. Така фрагмент от ДНК (съдържащ определен ген) от един организъм може да бъде прехвърлен в генома на друг като вторият ще произвежда специфичните за първия организъм белтъчини. Макар и рядко, се използват рестриктазни ензими, които срязват веригите тъпо (без едноверижни краища). В такива случаи след смесването на изрязания фрагмент и акцепторната молекула в реакционната смес се добавят специфични ензими, способни да съединяват тъпи краища, пише edu.uni-sz.bg.

За да се завърши процесът, е необходимо получените фаги или плазмиди носители на рекомбинантна ДНК да бъдат интрудоцирани в клетката реципиент. Механизмите, които най-често се използват, са трансдукция или трансфекция. Така рекомбинантният плазмид попада в клетката реципиент и започва да експресира както собствената си генетична програма, така и пренесеният фрагмент. Получената бактерийна популация се означава като клон, а методът на нейното получаване – молекулно клониране.

Една от най-трудните задачи пред генно-инженерните методи е пренасянето на целия набор от регулиращи фрагменти за съответният ген – промотор, регулатор и терминатор. При пренос единствено на кодиращата секвенция (без регулаторните области), генът не би могъл да се експресира. Всички описани до момента похвати се използват при трансгенозата в бактерии. Поради далеч по-сложния строеж на ДНК при еукариотите клонирането на ДНК при тези организми е далеч по-трудоемко.

Плазмидни вектори – използват се при ДНК клониране в бактерии. Тези вектори представляват генетично модифицирани плазмиди, съдържащи специфични нуклеотидни последователности, позволяващи лесно интегриране на чужди ДНК фрагменти. Почти винаги те съдържат един или няколко рестрикционни сайта, което позволява избор между няколко рестрикционни ензима в зависимост от ДНК фрагмента, който бихме желали да пренесем. Почти всички комерсиално разпространени вектори съдържат един или два гена за устойчивост към определени антибиотици, което ни позволява да отдиферинцираме колониите носители на плазмида от свободните от него. В повечето случаи са малки молекули, съставени от около 10 000 базови двойки невъзможни да се предават при конюгация. Липсата на конюгативна активност е от особено значение за блокирането на предаването им от една на друга бактерия. Това им свойство има предимно предпазен характер, тъй като бактериите, в които те се установяват са и нормални обитатели на бозайническия организъм (E. coli). Така дори при изнасяне на такава бактерия извън лабораторията тя не би могла да пренесе трансгенния плазмид.

Фагови вектори – обикновено представляват генетичномодифицирани щамове на фаг ламбда (λ). Харктерно за тях е, че при нормални условия, след инфектирането на бактериалната клетка, те инкорпорират своята ДНК молекула в тази на клетката. Така при реплицирането на бактериалната ДНК клетката реплицира и ДНК на фага. Модифицираните щамове използвани в генното инженерство позволяват една част от тяхната ДНК да бъде заменена с чужда. Така при инфектирането на бактерията, наред с участък от фаговия геном, се интегрира и избрана чужда молекула. Фагите използвани като вектори могат да пренасят молекули до 20 000 базови двойки, което дава възможност за клониране на доста големи ДНК фрагменти.

Изкуствени вектори – космиди, BAC и YAC. В повечето случаи те са продукт на генното инженерство като една част от техният геном е съставена от хромозома на фаг ламбда, а друга е изградена от плазмидна ДНК. Това, което ги отличава от предходните два вида е, че те могат да пренасят фрагменти от 50 000 до 300 000 базови двойки.

Прокариотни клетки – най-често използваната бактерия при ДНК клонирането е E. coli. Тъй като бактерията е нормален обитател на тънкочревният тракт на бозайниците се използват определени щамове на бактерията не способни да се развиват при нормални условия на средата. Ако оптималната температура за една бактерия, нормален обитател на бозайническият стомашно-чревен тракт е 37°С, то бактериите използвани при ДНК клонирането се развиват при 28°С.

Растителни клетки – при ДНК клонирането в растителни клетки най-често се използва векторът Agrobacterium tumеfaciens. Характерно за този бактериален вид е, че предизвиква развитието на тумори в инфектираните клетки. Тумор индуциращият ефект се дължи на специфичен плазмид в бактерията (Ti плазмид). След инфектирането на еукариотната клетка определен участък от този плазмид се интегрира в генома на еукариота и я принуждава да синтезира специфични белтъчини. Векторите, които се използват в генното инженерство са модифицирани и тумор индуциращият фактор е отстранен. На негово място е изграден рестрикционен сайт, който позволява интегрирането на чужд ДНК фрагмент. Така след инфектирането на клетката в нейният геном се трансферира чуждият ген внесен при лабораторни условия.

Бозайнически клетки – най-често трансгенозата при тях се извършва посредством процеса ендоцитоза. Първоначално специфичните ДНК фрагменти се прехвърлят в изкуствени липозоми, чиито фосфолипидни мембрани в последствие се сливат с клетъчните мембрани на бозайническите клетки. Така чуждовидовата ДНК молекула се прехвърля в бозайническата клетка. Инкорпорирането на ДНК фрагмент в бозайническите клетки може да се извърши и посредством вектори базирани на ретровируси. Тези вируси използват за матрица иРНК от която синтезират двойноверижна ДНК молекула. В последствие тази молекула се интегрира в еукариотният геном и се реплицира при всяко делене на клетката. Друг метод за пренасяне на ДНК фрагменти в клетките на бозайници е посредством създаването на изкуствени хромозоми (YAC), в които се интегрират желаните чуждовидови ДНК вериги.

Генното инженерство е едно от най-иновативните открития на човечеството. То дава нова посока за развитие на гентиката, молекулярната биология и не на последно място - биоетиката. Рекомбинантните ДНК технологии се превърнаха в широко използван похват за производство на различни протеини необходими на човека, в това число хормоните соматотропин, инсулин, интерферон и др.

Генното инженерство позволява прекрачването на видовите бариери и рекомбинирането на генетичната информация между видовете. Експериментално е показана трансгеноза между риба и домат, като ген придаващ устойчивост към замръзване от риба бил прехвърлен в домат. Полученото растение придобива устойчивост към замръзване, което го прави приспособимо в климатични пояси, при които преди това не е могло да бъде отглеждано. Не на последно място трябва да споменем и перспективите, които генното инженерство ни дава в борбата с инфекциозните и наследствените заболявания по хората и животните.